二級生物安全柜可以保持正常穩定的進氣流速——105fpm，通過一個傾角為100度的開放式吊窗設計從而徹底解決了操作過程中的反光問題，是設計上的一大突破。在操作中，室內空氣被抽入前面的格柵。在工作表面下的壓力通風系統里，空氣是未經過濾的室內氣和剛剛流過作業區的氣體的混合體。這些已污染的空氣被風機抽入柜子背面的通風系統里，在那里大約70%的氣體再循環，通過HEPA過濾返回作業區。剩下的污染氣經過排氣HEPA過濾排出，不會對周邊環境產生污染。
　　即使是NSF國際標準也未要求這樣的生物安全柜具有額外安全措施，但所有生物安全柜已具有——污染空氣的正壓力管道必須圍繞以負壓通風系統。如果有孔或泄露發生，負壓將再次捕捉污染空氣，迫其通過HEPA濾膜，防止其彌散入室內。
　　二級生物安全柜可以在通過HEPA過濾后直接排入實驗室，或者通過選配的蓋式排氣連接配件排入排氣系統。